Программа курса «Молекулярная микробиология», 2012 год
Читает асс. А.В. Летаров
I. Предмет и история микробиологии.
Возникновение представлений о микроорганизмах. Ранние микроскопические исследования. Работы А. ван Левенгука. Развитие микробиологии в 18-19 веках: Л. Спаланцани, Д.Самойлович, Л. Пастер, Р. Кох, С.Н. Виноградский, М. Бейеринк. Открытие вирусов и бактериофагов.
II. Введение в клеточную биологию бактерий.
Отличия прокариот и эукариот. Филогения прокариот. Эубактерии и археи. Гр+ и Гр- бактерии. Морфология бактерий. Адаптивное значение формы клеток. Схема строение бактериальной клетки: капсулы, клеточная стенка Гр+ и Гр- типа, S-слой, пили, фимбрии и жгутики, клеточная мембрана и связанные с ней органеллы, цитоплазма и цитоскелет, цитоплазматические включения, газовые вакуоли.
III. Организация макромолекулярных синтезов в бактериальной клетке. Cинтез ДНК.
Организация генома и синтез ДНК. Размеры и топология хромосом бактерий. Репликационная вилка. Цикл репликации. Понятие репликона. Плазмиды бактерий. Совместимость плазмид. Латеральный перенос ДНК – конъюгация, трансформация и трансдукция.
IV . Организация макромолекулярных синтезов в бактериальной клетке. Cинтез РНК и белка.
Организация транскрибции. РНК-полимераза. Промоторы и терминаторы. Оперон. Регуляция транскрибции на уровне инициации: белки-активаторы, белки-репрессоры, сигма-факторы. Другие механизмы регуляции транскрибции. Рибосомы. Элонгационный цикл. Генетический код. Инициация трансляции у бактерий. Терминация трансляции. Фолдинг белка. Деградация белков в клетке.
V . Рост и размножение бактерий. Синтез клеточной стенки.
Строение муреина. Синтез муреинового слоя бактерий. Пеницилин-связывающие белки и их функции. Пространственная организация синтеза муреина и бактериальный цитоскелет. Тейхоевые кислоты. Их синтез и транспорт. Синтез внешней мембраны. ЛПС, их строение, функции, ситнез и транспорт. Липопротеины, порины и другие белки ВМ. Их транспорт и включение в мембрану.
VI . Рост и размножение бактерий. Цитокинез.
Выбор сайта деления клетки. Осциллирующие белки. Другие механизмы. FtsZ и дивидисома. Синтез муреина клеточной перегородки.
VII . Клеточная дифференциация у бактерий.
Примеры дифференцированных клеток. Покоящиеся формы, экзо и эндоспоры. Гетероцисты цианобактерий. Споруляция как модификация клеточного деления. Регуляция споруляции у бацилл – фосфореле. Споруляция как стадия жизненного цикла. Стадии споруляции. Обмен сигналами между спорангием и проспорой. Морфогенез споровых оболочек. Причины устойчивости спор к повреждающим факторам. Прорастание спор: сигналы, вызывающие прорастание. Последовательность событий при прорастании споры.
VIII . Движение бактерий.
Разнообразие механизмов движения бактерий. Плавание с .помощью жгутиков. Строение жгутика и принцип его работы. Сборка жгутиков и ее регуляция. Механизмы контроля морфогенеза. Ориентация бактерий в пространстве. Хемотаксис. Механизмы контроля переключения жгутика. Другие таксисы.
IX . Бактериофаги.
Распространенность фагов в природе. Жизненные циклы бактериофагов. Литический и лизогенный цикл. Развитие фага внутри клетки на примере хвостатых фагов. Принципы морфогенеза бактериофагов. Другие семейства бактериофагов. Экологическое значение фагов и их роль в эволюции бактерий.
Х. Бактерии и болезни.
Принципы работы иммунной системы. Неспецифический иммунитет к бактериальным инфекциям. Воспалительная реакция. Септический шок. Специфический иммунитет. Антитела. Принцип клональной селекции. Взаимодействие с неспецифическим звеном иммунного ответа. Аутоиммунные реакции. Факторы патогенности бактерий: факторы адгезии и инвазии. Защита бактерий от действия иммунной системы. Токсины бактерий и их действие.
ХI . Бактерии в природе.
Микробное сообщество. Функциональная организация сообщества. Обмен субстратами. Экологические стратегии микроорганизмов. Пространственная структура сообществ. Биопленки. Бактериальные маты. Роль бактерий в глобальных циклах элементов. Цикл углерода. Цикл азота. Бактерии и геологическая эволюция Земли.
Бактерии — обширная группа живых организмов, преимущественно одноклеточных, у которых отсутствуют ядра. Они в основном представлены одиночными клетками, но встречаются и бактерии, образующие «союзы», например стрептококки выстраиваются цепью, а стафилококки сбиваются в гроздья. Также для бактерий характерно формирование пленочных структур, биопленок, и это затрудняет лечение бактериальных инфекций у человека — ведь сцепленные вместе бактерии сильнее, они создают сложные структуры и выступают единым фронтом. Таким свойством обладает, например, синегнойная палочка.
Наш мир просто кишит бактериями, они обнаруживаются в литосфере на большой глубине, в горячих источниках, во льдах, — и без них жизнь на Земле была бы невозможна. Многие виды бактерий полезны или хотя бы не вредны (на теле человека живут миллиарды их, не причиняя зла), но есть и крайне опасные убийцы, такие как энтеробактерия чумная палочка, погубившая в середине XIV века в разных регионах Европы от 20 до 90 процентов населения. Великая победа науки в том, что она победила чуму, но вот что делать с бактериями, которые сегодня приспосабливаются к антибиотикам и порождают всё новые, агрессивные штаммы? Это огромное поле для исследований микробиологов.
Строение бактерий
- Клеточная стенка. Бактерию-клетку защищает плотная оболочка из биополимера муреина. Она также служит опорой, создает форму клетки, а среди бактерий встречаются как простые шарики (кокки, а слитые в пары — диплококки), так и спирали (спириллы), запятые (вибрионы), звезды, тетраэдры. Нередко клеточная стенка снаружи дополнительно покрыта слоем слизи — эта капсула оберегает клетку от избыточной потери влаги.
- Цитоплазма. Внутреннее содержание бактерий неподвижное и густое. Цитоплазма слоистая, содержит запасные питательные вещества и ферменты.
- Ядерное вещество. В центре клетки находится нуклеоид — скопление ядерного вещества, хранящего наследственную информацию. ДНК бактерий имеет форму кольца. Ядерное вещество бактерий не окружено оболочкой-мембраной и не может считаться полноценным ядром, — именно поэтому бактерии являются прокариотами, доядерными живыми организмами.
- Жгутики. На поверхности бактерии есть микроскопические жгутики, количество их отличается у разных видов: от одного до множества. Жгутики выполняют двигательную функцию. Организмы, не имеющие жгутиков, перемещаются особым способом, называемым «скольжение», причем даже по твердым поверхностям.
- Органоиды. Бактерии лишены почти всех органоидов, у них нет ЭПС, митохондрий, лизосом, аппарата Гольджи, пластид. Такая обделенность компенсируется в какой-то мере наличием маленьких дополнительных ДНК, плазмид. Одна из важных функций плазмид — хранить гены, которые повышают невосприимчивость бактерий к антибиотикам и прочим агрессивным факторам.
Размножение бактерий
Половое размножение бактерий примитивно, в ходе него происходит генетическая рекомбинация. В основном же популяция бактерий увеличивается при помощи бесполого размножения — простого деления без митоза. На первом этапе делится кольцевая ДНК, за ней разделяется цитоплазма. Деление бактерий происходит с малым интервалом — каждые 20–25 минут. Если бы выживали все «новорожденные» клетки, одна бактерия могла бы оставить потомство общим весом 1 800 000 килограмм. У некоторых групп бактерий наблюдается почкование, при котором на материнской клетке растет дочерняя почка.
Хочешь сдать экзамен на отлично? Жми сюда — подготовка к ОГЭ по биологии
Основные понятия
Для микроорганизмов, как и для других живых существ, характерны рост и размножение. Под ростом клетки подразумевают согласованное увеличение количества всех химических компонентов (например, белка, РНК, ДНК), ведущее в конечном счете к возрастанию размеров и массы клетки. Рост клетки не безграничен, достигнув определенной величины, она прекращает рост и начинает размножаться. Размножение — это увеличение числа клеток микроорганизмов в популяции. Микроорганизмы размножаются поперечным делением, происходящим в процессе роста, почкованием или образованием спор.
Размножение. Прокариоты обычно размножаются бесполым путем — бинарным делением. В начале деления клетка удлиняется, затем делится нуклеоид. Воспроизведение нуклеоида, содержащего всю генетическую информацию, необходимую для жизнедеятельности микроорганизма, — наиболее важный из всех процессов, которые происходят при росте клетки.
Нуклеоид представлен суперспирализованной и весьма плотно уложенной молекулой самореплицируюшейся ДНК, известной под названием репликона. К ре пли конам относят также плазмиды — генетические структуры, способные к самостоятельной репликации. Репликация ДНК осуществляется при участии ферментов ДНК-по- лимераз. Процесс начинается в определенной точке ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Заканчивается репликация также в определенном месте ДНК.
В результате репликации количество ДНК в клетке удваивается. Вновь синтезированные молекулы ДНК постепенно расходятся в образующиеся дочерние клетки. Все это позволяет дочерней клетке иметь совершенно тождественную материнской по последовательности нуклеотидов молекулу ДНК. Считают, что репликация ДНК занимает почти 80% всего времени, затрачиваемого бактериальной клеткой на деление.
После завершения репликации ДНК наблюдается целый комплекс процессов, ведущих к образованию межклеточной перегородки. Начинаются они с врастания двух слоев цитоплазматической мембраны с обеих сторон клетки, затем между слоями мембраны синтезируется пептидогликан и, наконец, формируется перегородка из двух слоев цитоплазматической мембраны и пептидогликана.
Во время репликации ДНК и образования делящей перегородки клетка микроорганизма непрерывно растет. В этот период происходят синтез пептидогликана клеточной стенки и составляющих цитоплазматической мембраны, образование новых рибосом и других органелл и соединений цитоплазмы. На последней стадии деления дочерние клетки отделяются друг от друга. У некоторых видов бактерий процесс идет не до конца, в результате образуются цепочки клеток.
При делении палочковидных бактерий клетки вначале растут в длину (диаметр клетки не меняется). Когда бактерии становятся вдвое длиннее, палочка несколько сужается посередине, а затем распадается на две клетки. Таким образом, рост клетки идет вдоль длинной оси, а деление осуществляется в плоскости, перпендикулярной этой оси. Чаще всего клетка делится на две равные части (изоморфное деление), однако встречается и неравномерное (гетеро— морфное) деление, когда дочерняя клетка больше материнской.
На рисунке 34 показано окончание деления бактерии со жгутиками. Жгутики остаются у материнской клетки, у дочерней они вырастают позднее. При многочисленных исследованиях жгутики обычно находили только у одной клетки из недавно разделившейся пары. Можно полагать, что материнская клетка сохраняет главную часть первоначальной клеточной стенки, фимбрии и жгутики.
Спирохеты, риккетсии, а также некоторые дрожжи и мице- лиальные грибы, простейшие и другие организмы размножаются поперечным делением клеток. Миксобактерии делятся перетяжкой. Сначала клетка в месте деления слегка сужается, далее
Рис. 34. Недавно разделившаяся клетка бактерии рода Klebsiella. Электронная микрофотография, х 2500 (по: К. Дугюл)
клеточная стенка, постепенно впячиваясь с обеих сторон внутрь клетки, все больше и больше сужает ее и, наконец, делит на две. Дочерняя клетка, одетая уже собственной цитоплазматической мембраной, еше некоторое время сохраняет общую клеточную стенку.
Почкование у бактерий представляет собой разновидность бинарного деления и у ряда форм почти не отличается от деления. Например, у нитрифицирующих (Nitrobacter) и некоторых фотосинтезирующих (Rhodopseudomonas) бактерий клетки делятся, но растут лишь с одного полюса материнской клетки, поэтому образующиеся новые клетки неравноценны — в большинстве случаев между ними можно обнаружить морфологические отличия. Иногда у бактерий наблюдается половой процесс, или конъюгация (см. главу 4).
Клеточные циклы бактерий. Бактериальная клетка проходит от деления к делению клеточный цикл, равнозначный онтогенезу (периоду от возникновения бактериальной клетки до прекращения ее существования). При отсутствии дифференциации клеточный цикл бактерий представляется вегетативным клеточным циклом, который включает процессы, связанные с ростом и делением. У бактерий выделяют три типа вегетативного клеточного цикла:
- • мономорфный, когда при делении образуется только один морфологический тип клеток;
- • диморфный, когда при делении образуются две клетки, отличающиеся формой, размерами и другими признаками;
- • полиморфный, свойственный бактериям, которые в зависимости от состава среды могут образовывать клетки двух и более морфологически разных типов.
Для большинства бактерий характерен мономорфный клеточный никл. До наступления деления клетка проходит ряд периодов. Началу репликации хромосомы (инициации) предшествует период А, во время которого у новой клетки синтеза ДНК не происходит. Затем наступает период С, во время которого осуществляются инициация репликации, репликация ДНК и ее терминация. Третий период — D занимает время от репликации хромосомы до разделения клеток. В ряде случаев выделяют также и Т-период, который занимает время от начала до конца образования перегородки или перетяжки между вновь образованными дочерними клетками.
Диморфный клеточный цикл наблюдается у грамотрица- тсльных бактерий, он характерен, например, для представителей рода Caulobacter и некоторых почкующихся форм. В процессе размножения Caulobacter образуются два типа клеток — подвижные со жгутиками и неподвижные со стебельком. Подвижные клетки обычно рассматриваются как дочерние, неподвижные со стебельками — как материнские.
Полиморфный клеточный цикл свойствен бактериям таких родов, как Arthrobacter, Hyphomicmbium, Rhodomicrobium и др. Наиболее характерный представитель бактерий с полиморфным циклом — Arthrobacter. Сначала у него формируются палочковидные неправильной формы клетки, затем переходящие в кокки; последние удлиняются, превращаясь в палочки. Интересной особенностью палочковидных бактерий данного рода является их способность при делении образовывать фигуры, подобные римской цифре V.
Для некоторых бактерий характерно образование специализированных клеток и особый порядок прохождения жизненных циклов (неточная дифференцировка бактерий). Так, у представителей семейства Bacillaceae наблюдается образование эндоспор, семейства Azotobacteriaceae — цист, пурпурной несерной бактерии Rhodomicrobium — экзоспор. Для многих облигатно паразитических и симбиотических бактерий характерно образование специализированных клеток, называемых элементарными тельцами (ЭТ).
Миксобактерии отличаются сложными жизненными циклами. Их палочковидные клетки с закругленными или заостренными концами способны ползать по плотному субстрату. Размножаются вегетативные клетки бинарным делением. В определенных условиях, чаще при истощении пищи и на поверхности твердого субстрата, клетки миксобактсрий собираются и образуют плодовые тела, которые состоят из слизи и дифференцированных покоящихся клеток, называемых миксоспорами, или микроцистами.
Время генерации. В результате роста и размножения из одной клетки микроорганизма образуется колония его потомков. Микроорганизмы отличаются высоким темпом размножения, оцениваемым по времени генерации, т. е. времени, в течение которого происходит деление клетки. Время генерации неодинаково у разных видов микроорганизмов, у клеток одною вида, но разного возраста; оно зависит также от условий роста (состава питательной среды, температуры, pH и других факторов).
При благоприятных условиях время генерации многих микроорганизмов колеблется от 20 до 30 мин. При такой скорости роста можно получить шесть генераций за 2 ч (у человека столько же поколений проходит за 120 лет). Вследствие способности к быстрому размножению в природе бактерии численно превышают все другие живые организмы. Однако бактерии не могут очень долго продолжать расти с периодом генерации 20 мин. Если бы такой рост был возможен, то из одной-единственной клетки кишечной палочки через 24 ч образовалось бы 2 72 , или около I0 22 потомков, общая масса которых составила бы несколько десятков тысяч тонн, а сше через 24 ч роста бактерии масса ее потомков превысила бы в несколько раз массу земного шара. Недостаток пиши и накопление продуктов распада ограничивают столь бурное размножение бактерий. Однако в проточной среде они способны делиться каждые 15—18 мин.
Фазы цикла развития культуры бактерий. Наблюдения за ростом микроорганизмов, культивируемых на жидкой среде в замкнутых резервуарах, показывают, что скорость их роста изменяется во времени. Внесенные в питательную среду микроорганизмы сначала не развиваются — «привыкают» к условиям среды. Затем начинается размножение со все возрастающей скоростью, достигающей максимальной, на которую данный вид способен в данной среде. По мере исчерпания запаса питательных веществ и накопления продуктов обмена рост замедляется, а затем прекращается полностью. Цикл развития культуры бактерий состоит из ряда фаз (рис. 35).
Рис. 35. Фазы роста бактерий: I — исходная (стационарная фаза); II — фаза задержки размножения; III — логарифмическая фаза; IV — фаза отрицательного ускорения; V — стационарная фаза максимума; VI — фаза ускорения гибели клеток; VII — фаза логарифмической гибели; VIII — фаза уменьшения скорости отмирания
Первая фаза — исходная, или стационарная. Начинается после внесения микроорганизмов в питательную среду и продолжается 1—2 ч. Количество бактерий во время этой фазы не увеличивается, и клетки не растут.
Вторая, или л а г-фаза, — период задержки размножения. В указанное время бактерии, внесенные в свежую питательную среду, начинают интенсивно расти, но скорость их деления пока невысока. Две первые фазы развития бактериальной популяции называют периодом приспособления к новой среде. К концу лаг-фазы клетки часто увеличиваются по объему. Длительность лаг-фазы зависит как от внешних условий, так и от возраста бактерий и их видовой специфичности.
Третья фаза — интенсивного логарифмического, или экспоненциального, размножения. В этот период размножение бактерий идет с наибольшей скоростью и число клеток увеличивается в геометрической прогрессии.
Четвертая фаза — отрицательного ускорения. Клетки бактерий становятся менее активными, и период генерации удлиняется. Одна из причин, замедляющих размножение бактерий, — истощение питательной среды и накопление в ней токсичных продуктов обмена. Это замедляет ритм размножения. Некоторые клетки перестают размножаться и погибают.
Пятая фаза — стационарная. Период, когда число вновь возникающих клеток примерно равно числу отмирающих. Поэтому количество живых клеток некоторое время остается практически неизменным. Однако общая численность живых и мертвых бактерий несколько увеличивается, хотя и не очень быстро. Данную фазу иногда называют максимально стационарной, так как численность клеток в среде во время нее достигает максимума.
Шестая — восьмая фазы — отмирания — характеризуются тем, что отмирание клеток преобладает над размножением. Во время прохождения шестой фазы увеличивается число отмерших клеток. Седьмая фаза — логарифмической гибели клеток, когда они отмирают с постоянной скоростью. Во время восьмой фазы скорость отмирания клеток бактерий постепенно уменьшается. Отмирание в последние три фазы связано с изменением физико-химических свойств питательной среды в неблагоприятную для бактерий сторону и другими причинами. Ритм гибели клеток в эти фазы становится быстрым, и число живых клеток все более снижается, до тех пор пока они почти полностью не отмирают.
В описанных выше фазах развития микроорганизмов при культивировании в замкнутом резервуаре последние все время находятся в меняющихся условиях. Это так называемая непроточная культура микроорганизмов. Первое время они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно начинают проявляться нсдостаток в питании и отравление продуктами обмена. Все указанное и приводит к снижению скорости роста, в результате чего культура переходит в стационарную фазу.
Однако если добавлять в среду питательные вещества и одновременно удалять продукты обмена, то микроорганизмы могли бы пребывать в течение неопределенного времени в экспоненциальной фазе роста. Такой способ положен в основу проточного культивирования микроорганизмов, осуществляемого в хемостатах и турби- достатах при помощи специальных устройств, обеспечивающих непрерывную подачу среды с регулируемой скоростью и хорошее ее перемешивание. В результате для микроорганизмов создаются неизменные условия, что позволяет поддерживать непрерывный и постоянный прирост клеток при любой скорости роста культуры. Проточное культивирование микроорганизмов поддается автоматическому регулированию, оно весьма перспективно и широко внедряется в практику.
В исследованиях физиологии микроорганизмов важно получение синхронных культур. Так называют бактериальную культуру, или популяцию, в которой все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла. Синхронные культуры обычно используют для изучения процессов роста у отдельных видов бактерий.
Контрольные вопросы и задания
1. В чем выражается рост микроорганизмов? 2. Как происходит размножение микроорганизмов? 3. Какие существуют типы вегетативного клеточного цикла? 4. Кратко охарактеризуйте основные фазы цикла развития культуры бактерий.
